John Cameron Mitchell est né à El Paso. Fils d'un général à la retraite de l'armée des États-Unis, il grandit sur des bases militaires à Colorado Springs dans le Colorado, et suit une éducation catholique. Sa mère est écossaise, émigrée aux États-Unis pendant sa jeunesse.
Mitchell écrit Hedwig and the Angry Inch, une comédie musicale sur Hedwig, une musicien de rock transgenre à la poursuite de son ancien amant qui a plagié ses chansons en 1998. Trois ans après, il se met en scène dans le rôle principal avec dans une version cinématographique de Hedwig. Le film et la comédie sont des succès remarqués et deviennent cultes.
Mitchell joue aussi dans la version comédie musicale de The Secret Garden ainsi que dans Hello Again, pour lequel il est nommé au Drama Desk en 1994. On l'entend sur les enregistrements originaux des deux comédies.